新双功能抗PD-L1/TGFβ抑制剂M7824临床研究

Oncoimmunology. 2017 Jul 13;6(10):e1349589. doi: 10.1080/2162402X.2017.1349589. eCollection 2017.
A novel bifunctional anti-PD-L1/TGF-β Trap fusion protein (M7824) efficiently reverts mesenchymalization of human lung cancer cells.
标题：一个新双功能抗PD-L1/TGFβ陷阱蛋白（M7824）有效逆转人肺癌细胞的间质化（已进入临床）
摘要:
间质化是一种细胞和分子程序，在此程序中，上皮细胞逐渐失去其良好分化的表型，并采用间质性特征。肿瘤间质化发生在癌症发生转移的过程中，同时也与多种治疗的耐药性有关，包括细胞毒性免疫细胞的死亡。此外，肿瘤细胞可以通过上调检查点分子PD-L1来避开免疫破坏，而新研究发现，在间质化肿瘤中发现了更高的PD-L1表达。本文研究了非小细胞肺癌细胞(NSCLC) TGF-β介导间质化与PD-L1之间的关系。发现以Smad2依赖的方式，TGF-β1上调PD-L1基因转录，在NSCLC肿瘤中发现了PD-L1和磷酸化Smad2之间的正相关。利用M7824对这两种负免疫调节因子的潜在作用进行了研究，这是一种新型的临床阶段双功能靶向药，靶点是PD-L1和TGF-β。用M7824治疗在体外和体内减弱了TGF-β介导的间质化，包括间质标记表达、增殖抑制和化疗耐药。这些结果表明，在NSCLC中肿瘤细胞PD-L1上调是TGF-β1诱导免疫抑制的一种新机制，而M7824的治疗有能力同时阻断肿瘤间间化和PD-L1的免疫抑制。
引言:
目前，正在进行的开发改良疗法探索的工作重点是借助患者自身的免疫系统对抗肿瘤的进展。近年来，使用靶向免疫检查点的单克隆抗体，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡-1(PD-1)和程序细胞死亡配体-1(PD-L1)，在不同的肿瘤类型中取得了令人鼓舞的临床结果1-3。特别是，PD-1/PD-L1检查点已经成为外围组织中调节T细胞活性阶段的效应子的关键抑制通路。pd-1是一种受体蛋白，由T细胞激活表达，与由抗原呈递细胞表达的跨膜蛋白PD-1和PD-L1结合，导致T细胞增殖、存活和效应子功能的抑制4-6。在几种恶性肿瘤中，PD-L1可能会被肿瘤细胞异常过度表达，导致浸润抗原特异性T细胞的抑制，并减少宿主的抗肿瘤免疫反应7,8。
在美国，肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因，大约有1/4的癌症死亡是由这种疾病引起的。非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%的病例，9年生存率仅为21%，远低于其他常见的癌症，如结肠癌、乳腺癌和前列腺癌10。NSCLC的治疗包括各种不同的细胞毒性化疗和分子靶向治疗，可以抑制特定的癌基因改变，如EGFR突变和ALK重排。然而，化疗的治疗只会对患者的生存产生微小的改善，而靶向治疗不可避免地会导致耐药而复发。改善以铂为基础的化疗或靶向治疗的患者整体生存率，导致FDA最近批准了2种抗PD-1检查点抑制剂， nivolumab和pembrolizumab，用于治疗NSCLC 11,12。另一种检查点抑制剂， avelumab，是一种完全人类的IgG1抗PD-L1单克隆抗体，它有能力介导人表达PD-L1的肿瘤细胞溶解，通过抗体相关的细胞毒性(ADCC)的机制13。avelumab临床研究表明，导致批准了对默克尔细胞癌(MCC)的治疗和膀胱癌的2个适应症，目前正在进行多个3期临床试验，包括NSCLC。有趣的是，肿瘤细胞和/或浸润性免疫细胞之间的PD-L1表达和对PD-1/PD-L1靶向治疗的临床应答已经显示出关联，但不是完美无瑕的; 只有少数的PD-L1-阳性肿瘤对这些治疗有反应，而某些PD-L1阴性肿瘤对治疗也有反应16-18。这增加了一种可能性，即额外的因素控制对PD-1/PD-L1靶向治疗的患者反应，并且必须确定额外的预测生物标记，以改善这些制剂的临床使用。
上皮间间质转变(EMT)是上皮细胞失去其特征性特性并获得间质显型特性的一种过程19。肿瘤细胞间的间质化被认为是导致肿瘤转移、干细胞和耐药性的中心机制20。通过介导抵抗细胞毒的免疫细胞的杀死作用21-25，促进抵抗抗肿瘤细胞毒26，和诱导抑制性免疫细胞在肿瘤部位，肿瘤细胞间间质化被证明保护肿瘤抵抗宿主的抗肿瘤免疫应答21,27。最近的进展表明，EMT也可能通过上调PD-L1抑制肿瘤的免疫力。在一份报告中，证实了一个EMT转录因子ZEB1抑制了PD-L1靶向miRNAs的表达，从而导致人类和小鼠肺癌细胞中升高PD-L1表达的内在机制28。类似地，mucin 1致癌c-末端亚基已被证实通过激活ZEB1来诱导肿瘤EMT，同时在转录水平诱导PD-L1表达，从而整合EMT的诱导与PD-L1的表达29。其他研究已经确定，由外源性可溶性因子治疗诱导的EMT细胞在正常和癌细胞中产生了PD-L1表达水平的提高30,31。最后，对独立人类肺腺癌数据集的综合分析显示，肿瘤EMT状态与多个免疫检查点升高高度密切相关，包括PD-L1 32。在目前的研究中，我们报告了TGF-β1，一种已知的多效细胞因子，可以诱导EMT和抑制抗肿瘤免疫的作用在数个表达PD-L1的上皮NSCLC细胞系33。在TGF-β1介导的间质化背景下，PD-L1的上调发生在转录层上通过Smad2磷酸化，Smad2是TGF-β1信号传导的一个关键下游效应子，在人类NSCLC肿瘤样本中发现了PD-L1表达和磷酸化Smad2之间的正相关。我们还报道了一种新型的双功能融合蛋白的使用，它被命名为M7824，它由一种基于一部分avelumab抗体的PD-L1抗体组成链接到2 个TGFβRII分子的胞外域。M7824最近在临床前研究中被证明是抗肿瘤活性(Lan et al .,在准备手稿),以及安全性和临床疗效的证据在最近的一次剂量递增一期研究,包括确认完成应答的宫颈癌病人和一个持久部分应答胰腺癌34,35(施特劳斯et al .,手稿准备)。在目前的研究中，M7824减少了NSCLC细胞中TGF-β依赖质间特性。此外，还发现TGF-β1介导的PD-L1的上调能增强NSCLC细胞对M7824介导的ADCC的敏感性。这些发现确认了PD-L1的上调是TGF-β1诱导抑制抗肿瘤免疫的另外一种机制，并为使用这一新的药物M7824来治疗NSCLC和可能的其他恶性肿瘤提供了进一步合理的理由。
结果:
TGF-β上调PD-L1表达在NSCLC细胞
肿瘤细胞EMT可由多种因素引起，包括钙黏蛋白E-cadherin丢失、癌基因激活和生长因子刺激36。为说明间质化对PD-L1表达的影响，肺癌细胞系(PC-9, H3255, A549和HCC4006)在体外暴露于TGF-β1，评估以下蛋白的表达，包括上皮钙粘蛋白E-cadherin，闭合蛋白occludin (分别是CDH1和OCLN)，间叶N-cadherin，纤连蛋白fibronectin，波形蛋白vimentin，snail, slug，锌指E盒绑定同源框1(分别是CDH2 FN1,VIM,SNAI1 SNAI2 ZEB1)。与未接受治疗的细胞相比， TGF-β1治疗诱导的EMT相关的改变，包括2细胞系(A549和HCC4006)的上皮基因表达降低，以及4个细胞系中增加间叶细胞基因表达mRNA和蛋白质水平。对细胞表面PD-L1水平的分析表明，TGF-β1在所有4个细胞系中都能达到甚至超过IFN-γ刺激细胞的水平。联合TGF-β1和IFN-γ治疗可以提高PD-L1的水平与单独一个治疗相比。在NSCLC细胞系TGF-β1也可以单独或与IFN-γ联合，构建较高的PD-L1表达基线(H441，HCC827，HCC2935，H226)，尽管程度较低。PD-L2 (B7-DC)表达，PD-1受体的另一种配体，也发现PC-9, A549和HCC4006细胞因TGF-β1治疗而上调，当与IFN-γ联合时。在mRNA水平上，TGF-β1增强了CD274(编码为PD-L1)和PDCD1LG2(编码为PD-L2)的表达，这一效果在TGF-β1和IFN-γ联合治疗中得到了进一步的提高。
TGF-β1增强 PD-L1基因转录（省略）
TGF-β1介导的PD-L1表达上调依赖Smad2（省略）
PD-L1 和磷酸化Smad2在人 NSCLC肿瘤标本
使用人类的NSCLC肿瘤微阵列来评估TGF-β信号与PD-L1表达之间的联系。由于TGF-β1诱导的PD-L1的上调是依赖于Smad2，因此肿瘤评估PD-L1和磷酸化的Smad2(p-Smad2)表达作为活性TGF-β信号的指示器。一组6个肿瘤的免疫组织化学染色显示强PD-L1染色，1号肿瘤和2号肿瘤显示适度的p-smad2染色。在4个PD-L1-阴性肿瘤中，只有肿瘤5有低水平的p-smad2染色。然后，这些观察结果被扩展到更大的72个可评估的NSCLC肿瘤样本中，其中23(31.9%)在可变强度中被染色呈阳性。对p-smad2染色强度的分类表明，大约一半(24/49，48.9%)的PD-L1阴性肿瘤表现出没有或低(1+)强度p-smad2染色。相反，没有发现PD-L1-阳性肿瘤为p-smad2-阴性，大多数(15/23，65.2%)显示中度(2+)或高(3+)强度p-smad2染色。此外，最高强度的p-smad2染色在PD-L1阳性肿瘤(9/23，39.1%)中显著增加，而不是PD-L1阴性肿瘤(7/49，14.3%)。总之，这些数据提供了体内证据，表明PD-L1蛋白表达可能与人类NSCLC肿瘤中活跃的TGF-β/Smad2信号相关联。

在NSCLC肿瘤样本中，PD-L1和磷酸化Smad2。(A)在肺肿瘤(T047微阵列)中对PD-L1和p-smad2进行染色。标度杆=75 μm. (B)从LC819t肿瘤微阵列的匹配样本中，对PD-L1和p-smad2进行染色。代表性图像表示PD-L1染色强度类别(0,1+，2+，3+)，标度杆=75 μm。插图显示了肿瘤细胞染色的放大图。(C)从PD-L1阴性和阳性肿瘤中对p-smad2染色强度进行分类。
TGF-β1介导PD-L1表达上调增强 NSCLC细胞对PD-L1靶向药物介导ADCC敏感性
由于TGF-β1被观察到上调PD-L1表达，可以想像，TGF-β1治疗可能会增强肿瘤细胞对ADCC的敏感性，这由靶向PD-L1IgG1抗体介导，包括avelumab和M7824。为了研究这一潜在的机制，ADCC 试验，使用捐赠的自然杀伤细胞(NK)细胞在未治疗的A549细胞或预治疗细胞，这些细胞或用TGF-β1、IFN-γ或两者联合治疗。在这些实验中，被NK细胞单独杀死或用不具约束力的人类IgG1治疗的细胞被用作参照。在试验中，对最高剂量avelumab (以下简称α-PD-L1)的治疗仅在未治疗A549细胞中介导了轻微的ADCC杀灭，显示了相对较低的PD-L1水平。不过，通过与TGF-β1或IFN-γ一起治疗，大大增加了α-PD-L1 A549细胞的死亡，并且联合治疗TGF-β1和IFN-γ进一步改善了ADCC杀伤，而不是单独治疗。ADCC 试验还采用了M7824，它结合了一种IgG1抗体，理论上也可以调节ADCC。M7824按α-PD-L1等分子比使用，同样在未经治疗的A549细胞中仅介导少量ADCC杀伤。然而，联合最高剂量的TGF-β1治疗大大地增强了对A549个细胞的杀伤，且联合TGF-β1和IFN-γ改善m7824介导的最大程度ADCC杀伤。
为了确定是否观察到的PD-L1上调是ADCC效果主要原因，使用了H520细胞，发现在TGF-β1和IFN-γ介导的PD-L1上调方面存在很大程度的缺陷。而试验中使用α-PD-L1只导致了少量的ADCC死亡在没有治疗的H520细胞。与A549细胞所观察到的相比，观察到治疗TGF-β1、IFN-γ或联合治疗未能显著提高未治疗的H520细胞的PD-L1介导的ADCC。这些观察结果表明，TGF-β1主要改善肿瘤细胞的ADCC通过靶点强化，而不是通过增加对NK介导溶瘤的内在敏感性。当M7824被用于H520细胞未经治疗或与TGF-β1、IFN-γ或两者联合的治疗时，没有发现ADCC的死亡。然而，重要的是，指出M7824已经被其他人(Jochemset等人所提交的手稿)所示，在大多数人的癌症细胞系中介导ADCC。总之，这些结果表明，在肿瘤细胞中TGF-β1介导的PD-L1上调可以成为有ADCC能力α-PD-L1药物的靶点。。
M7824阻滞和逆转外源性TGF-β1诱导的间质化在NSCLC细胞
与avelumab相反，M7824的TGF-β1陷阱部分使这个分子能够抑制TGF-β1, -β2和-β3 信号(Lan等，准备的手稿)。由于TGF-β1被发现在NSCLC细胞中增强了PD-L1表达，因此推测M7824可能能够利用肿瘤细胞这种独特现象，靶向肿瘤细胞PD-L1，从而拮抗TGF-β信号传导所驱动的间质化。这一潜在的效用首先是基于纳米级的对NSCLC细胞的基因表达的分析，分析未治疗vs TGF-β1单独治疗，或联合α-PD-L1或M7824 3 天(称为TGF-β1阻滞)。在对770个基因进行了分析后，发现TGF-β1治疗显著改变了PC -9和A549细胞中分别56个(7.3%)和136个(17.7%)基因的表达。如预期的那样，与α-PD-L1同步治疗，只会阻止TGF-β1 调节一小部分基因表达的改变 (pc-9细胞10/56和A549细胞33/136)。然而，与M7824同时治疗却发现，在pc-9和A549中，阻止TGF-β1诱导的大多数基因改变，分别是43/56(76.8%)和121/136(88.9%)。
接下来，通过使用传统的基于qrt-pcr和免疫印迹的方法来评估间质化的表型标记物，这些结果得到了扩展。观察到M7824删除TGF-β1，阻止PC-9和A549细胞中纤维蛋白和波形蛋白的诱导，并防止在A549细胞中丢失e-cadherin。类似地，在已经经历了TGF-β1 3天诱导的EMT细胞中，在随后的3天中同时治疗TGF-β1和M7824 (称为TGF-β1逆转)，在两个细胞系中减少了间叶纤维蛋白和波形蛋白vimentin，并在A549细胞中恢复了e-cadherin表达。同样的结果也在蛋白质水平中得到。相反，在阻滞或逆转治疗方案中，使用α-PD-L1治疗对表型标记表达没有实质性的影响。使用HCC4006细胞也获得类似的结果。分析在未经治疗或TGF-β1单独治疗或联合α-PD-L1或M7824的A549细胞磷酸化表达及Smad2和Smad3细胞总数，证明M7824具有明显阻止应答于TGF-βS的mad2和Smad3激活的能力。
最后，对单独使用TGF-β1或与M7824联合治疗的细胞功能特征进行了研究。在pc-9和A549细胞中，发现M7824逆转TGF-β1可以挽救由TGF-β1单独诱导细胞增殖的减少。接下来，TGF-β1治疗的PC-9细胞被发现对化疗药物多西他赛耐药。对α-PD-L1和M7824的比较结果显示，只有M7824恢复了tgf-1治疗的pc-9细胞对多西他赛杀伤的敏感性。M7824治疗也证明了在pc-9细胞中阻止或逆转TGF-β1诱导的细胞毒多西他赛、紫杉醇和吉西他滨耐药，及A549和HCC4006细胞中多西他赛耐药。总之，这些结果表明，M7824可以有效地对抗NSCLC细胞中TGF-β1介导的表型和功能变化。
M7824拮抗内源性TGF-β1诱导的间质化在NSCLC细胞
还评估了M7824在缺乏外源性TGF-β1的情况下减少间叶特征的能力。HCC4006和H460细胞系被选择用于这些实验，因为发现这些细胞分泌他们自己的TGF-β1。M7824治疗这些细胞，发现在两个细胞系mRNA水平上的上皮标记OCLN上调。在HCC4006细胞，M7824引起几个间叶相关基因明显减少,包括CDH2 FN1,VIM,SNAI1和ZEB1(编码为N-cadherin、fibronectin, vimentin, snail和锌指E-box绑定同源框1),而H460细胞显示更温和的应答只有CDH2和FN1转录明显减少。利用M7824和SD-208 (作为TGF-β1信号抑制的阳性参照)，对蛋白质表达进行了评估，这两种药物都在HCC4006细胞中引起vimentin波形蛋白表达大量减少，并在H460细胞中减少了fibronectin纤维蛋白的表达。对HCC4006细胞的进一步检查表明，M7824以剂量依赖性的方式降低vimentin表达，而用α-PD-L1治疗没有效果。HCC4006细胞M7824治疗也显示适度增加上皮细胞标志物occludin和降低间叶细胞标志物N-cadherin，并减少了snail表达。在H460细胞中，M7824治疗未检测到Occludin和N-cadherin，而snail的表达也没有改变。
随后，通过对来自EMT基因表达阵列的84个与EMT相关基因组成的一个小组的表达进行了采样，进一步扩大了这些观察结果。在HCC4006和H460细胞中，M7824的治疗导致了一种不同的基因表达模式相对于α-PD-L1治疗，并且发现更多的基因减少而不是增加。在EMT阵列中，M7824治疗下调以下间叶相关的基因，包括MMP2、SNAI1、VIM、ZEB1、FN1在HCC4006细胞中，以及TWIST1, MMP2, MMP3, MMP9和CDH2,在H460细胞。两个细胞系中只有5个基因减少，这表明在不同于细胞株M7824应答不同。总的来说，这些数据表明M7824在NSCLC细胞中引起了内源性的tgf-1诱导的间叶化。
M7824减少NSCLC肿瘤异种移植模型间叶特征
为了确定M7824对肿瘤生长和表型的影响，HCC4006细胞系异种移植在缺乏适应性免疫细胞(T和B细胞)的C.B-17 SCID 老鼠中生长，但仍然保留了天生的免疫能力。之所以选择HCC4006细胞，是因为这些细胞在没有外源性TGF-β1的情况下，应答于M7824失去了间充质特性，并且发现在体内表达可感知的PD-L1和vimentin。荷瘤小鼠使用溶媒 (HBSS),α-PD-L1,或M7824治疗15天一个周期。如图7所示, 在研究早期中M7824诱导统计学显著抑制肿瘤生长 (4和6天),研究完成时此效果没有了 (15天)。虽然M7824的暂时影响尚不清楚，但在此模型中缺乏适应性免疫应答，排除了有关这些药物的抗肿瘤能力的任何结论。相反，该模型被用于免疫组织化学分析来评估肿瘤表型。波形蛋白表达作为肿瘤间质化指标，因为观察到这个标记对M7824治疗强下调表达在HCC4006细胞体外。免疫组织化学染色(IHC) 波形蛋白在几乎所有HBSS和α-PD-L1治疗的肿瘤细胞显示强阳性-treated肿瘤(图7 b)。然而，在m7824治疗肿瘤的大多数肿瘤细胞中，观察到的大部分肿瘤细胞波形蛋白的表达都有明显的减少，一些细胞表现出几乎为阴性的染色(图7B)。波形蛋白染色也显示了肿瘤生长的组织学模式发生了显著的改变; HBSS-和α-PD-L1治疗肿瘤主要表现为簇状大小和形状不全的肿瘤细胞，有形状不全的核(图7B和andC)。相比之下，在m7824治疗的肿瘤细胞中，有相当一部分表达了较低水平的vimentin，并个头更大，有更大、更有规律的核，以及更有组织的组织结构，让人想起更高分化的表型(图7B和C)。这些观察结果表明，使用M7824而不是α-PD-L1治疗可以减少体内肿瘤细胞间的间质化。
图7.

探讨
肿瘤细胞表型的可塑性越来越多地得到承认，作为一种促进癌症进展和治疗耐药的中心机制。近年来，各种肿瘤类型的多篇报道描述了肿瘤细胞间间质化与PD-L1表达之间的联系30,41,42，特别是在肺癌中28,32,43,44。在当前的研究中，在TGF-β信号传导的背景下确定了这一联系的机制基础，在TGF-β1治疗这一过程中发现了，同时诱导肿瘤细胞EMT和升高PD-L1表达在几个NSCLC细胞系中。
之前在树突状细胞45,46，CD8+T细胞47，和正常的和癌变的乳腺细胞株30中发现了TGF-β1上调。TGF-β上调PD-L1也在之前报道2个表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌细胞株，这些细胞株TGF-β与FGF-2.31联合使用。本文提出的发现扩展这些早些时候观察，通过在多个非小细胞肺癌细胞株进一步描述这种现象特性,包括KRAS和EGFR突变细胞系。这里提出的数据也表明，TGF-β1介导PD-L1上调也可以类似地发生在含有KRAS(A549、H441)或EGFR(pc-9、H3255、HCC4006、HCC827)突变的细胞系中，因此暗示TGF-β1介导的免疫抑制不依赖于这些致癌突变的存在与否。不仅如此，目前的研究还表明，在nclc细胞中，一种新的TGF-β1与IFN-γ之间的功能协同上调PD-L1和PD-L2。值得指出的是，我们的研究结果与先前报道的结果不同，在本结果中，正常的鼠肾管上皮细胞PD-L1表达显示为下调，而不是上调应答于TGF-β48。尽管目前尚不清楚这一差异的原因，但仍需确定的是，使用鼠与人的细胞，还是使用正常的与癌上皮细胞，可以解释不同的TGF-β1的不同活性。
报告的另一个新方面与TGF-β1控制PD-L1表达的机制有关，这种机制被发现是通过CD274基因的转录激活而产生的，而不是增加mRNA的稳定性。其他人的研究报告指出，调控PD-L1mRNA稳定性的miRNAs，包括miR-200,28 miR-34,37 and miR-138–5p.38。TGF-β已经被证明能够抑制这些miRNAs,49–51它将被预测稳定pd-l1 mRNA;然而，在这里报道的研究中没有发现PD-L1 mRNA稳定性的增强。这些不同的结果可能是由于TGF-β治疗的剂量和/或持续时间的不同，或者是细胞系的差异在TGF-β信号传导后的下游事件中。在这两种PD-L1调控机制之间是否存在潜在的协同作用仍有待研究。
序列分析确定了在TSS上游2kb区域内至少7个以前未描述的可能SBEs，在较短的启动子结构中失去了这些调控元素，通过TGF-β1消除CD274基因的任何转录激活，但不是通过IFN-γ。我们很容易推测这7个序列是功能性的SBEs，但是这2kb区域内的其他序列仍然有可能负责TGF-β1对PD-L1上调。尽管如此，这些数据表明，TGF-β1和IFN-γ合作激活CD274基因通过不同的调节位点，随着2个细胞因子治疗，为观察到的PD-L1上调的协同作用提供了事实基础。另外，由于TGF-β1介导PD-L1的激活非常依赖于Smad2激活，不是Smad3也不是几个非规范的信号通路，被发现在PD-L1的调控中起着作用。对TGF-β信号应答诱导Smad2和Smad3与Smad4寡聚化，这两个复合物在保守的SBEs区绑定DNA。然而，先前的报道认为，这些Smads具有重叠和非重叠的靶基因结合特异性，从而导致转录激活的不同特征52,53。据我们所知，这是Smad2第一次被报道在肿瘤细胞中调节PD-L1表达。有趣的是，TGF-β1最近被发现通过一种转录机制，上调抗原特异性T细胞上PD-1，发现Smad3绑定在PD-1基因启动子内SBEs 54。当一起考虑到这些数据时，可以理论化一个模型，在肺肿瘤微环境中TGF-β信号通过不同的方式诱导PD-1 通路介导的免疫抑制，通过肿瘤细胞不同驱动基因，(通过Smad3)在抗原特异性T细胞上表达PD-1和 (通过Smad2)在肿瘤细胞上表达PD-L1。
这里的研究也表明，在一些人类肿瘤样本中，升高的PD-L1表达和活化TGF-β信号(p-smad2)之间存在可能的关联。然而，应该指出的是，这种关联并不完美，很可能是由于人类肿瘤的表型和基因型异质性。例如，我们观察到，PD-L1阴性肿瘤中有一部分对p-smad2表现出明显的染色，这意味着其他因素可能在干扰TGF-β介导PD-L1的控制中发挥作用。相反，某些PD-L1-阳性肿瘤对p-smad2只有微弱染色，因此突出了已知其他因素(如，IFN-γ信号，表皮生长因子受体激活，等)在调控PD-L1表达中占主导地位的可能。未来的研究将对大量的人类肿瘤样本进行分析，以进一步验证这些观点。
作为一种融合蛋白，M7824被设计成具有独特拮抗PD-1/PD-L1和TGF-β信号交互的能力。虽然最初是为了抑制TGF-β诱导免疫抑制，但M7824也减弱了由TGF-β所驱动的NSCLC间间质化; 这个新特性已经在本研究中报道。通过TGF-β的肿瘤细胞间间质化与增强的间叶细胞基因表达有关，更慢通过细胞周期，并增强了治疗的耐药。结果发现，在外源性TGF-β1治疗的肿瘤细胞中， M7824阻止细胞间质基因表达，并从外源性和内源性生产的TGF-β1中逆转了已形成的EMT特性。M7824还通过增强细胞增殖和恢复肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，从而阻碍了TGF-β信号传导的功能效应。这一发现与之前的一份报告一致，即TGF-β信号抑制导致了NSCLC细胞的化学敏感化。最后，在体内部分免疫缺陷的NSCLC异种移植模型的评估中发现，M7824减少了间叶间质蛋白的表达，改变了肿瘤组织学类型，使其看起来更像上皮组织。未来的研究应该与其他抗肿瘤药物联合评估M7824。除了描述TGF-β1对PD-L1的调控控制外，还确定了这种机制可以被PD-L1靶向药物来利用通过ADCC杀死肿瘤细胞。在此进行的实验发现，由TGF-β1和/或IFN-γ产生的PD-L1上调导致增强M7824介导的ADCC。目前，avelumab已被批准用于治疗MCC和2个膀胱癌适应症，并正在多种肿瘤类型的进行三期临床试验。M7824最近在I临床试验阶段的剂量升级部分进行了评估(施特劳斯等人，准备的手稿)，目前正在对各种不同的适应症进行评估。目前的研究表明，M7824具有至少4种抗肿瘤的特性，包括(1)阻断免疫抑制的pd-1/l1检查点; (2)通过ADCC直接杀死肿瘤细胞的能力; (3)抑制TGF-β诱导的免疫细胞抑制的能力; (4)破坏TGF-β诱导的肿瘤细胞间质化的能力，而avelumab仅具备前两种特性。由于M7824抑制了TGF-β信号，我们在TGF-β-信号与PD-L1表达之间的关联的数据也表明，长时间暴露于M7824可能会减少PD-L1的表达。尽管从使用双功能药物的角度来看，这可能是违反直觉的，但从临床的角度来看，在肿瘤中表达PD-L1是一个不利因素，因为它可以抑制抗瘤T细胞的免疫反应。因此，正如M7824所报道的那样，通过对TGF-β1设陷阱降低PD-L1表达对患者来说是有益的，因为它可以缓解PD-L1依赖的免疫抑制。
有趣的是，过去对TGF-β小分子抑制剂的评估在患者中产生了毒性，但据报道M7824在一期的研究中有可接受的毒付作用，其中最大耐受剂量没有达到，3435(斯特劳斯等人，准备的手稿)。虽然使用TGF-β系统抑制剂可能会导致毒性，貌似M7824通过这种分子的抗PD-L1部分优先肿瘤定位可能会导致系统毒性最小化，同时也能降低肿瘤的TGF-β水平，从而增强局部的抗肿瘤免疫应答。总之，这项研究表明，TGF-β1是肿瘤细胞间间质化与NSCLC升高的PD-L1表达之间的分子链，这表明NSCLC肿瘤细胞PD-L1上调是TGF-β1诱导免疫抑制一种新的机制。此外，这种现象还被利用以诱导PD-L1为靶点的ADCC来杀死肿瘤细胞。最后，利用M7824有效拮抗肿瘤细胞间质化，一种双功能抑制剂，靶向PD-L1和TGF-β信号传导，但α-PD-L1不行。这些发现为NSCLC患者开发M7824以及可能的其他恶性肿瘤提供了合理的支持理由，包括那些对PD-1/PD-L1抑制剂治疗进展的患者。
参考文献
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